Медицинские статьи
Новости для специалистов

Коммерческие предложения
Документация
Медицинские статьи
Нормативные документы
Ссылки на статьи в мед изданиях

Антибиотикорезистентность методом ПЦР

 Сегодня при бактериальных инфекциях наиболее часто назначаются b-лактамные антибиотики, среди которых различают пенициллины (ампициллин, метициллин), цефалоспорины (цефтриаксон, цефиксим) и карбапенемы (имипенем, меропенем). Они имеют долгую историю использования, являются безопасными и эффективными против широкого спектра бактериальных возбудителей инфекций. Однако масштабное и долгосрочное использование противомикробных препаратов этого класса привело к появлению и распространению микроорганизмов, реализующих лекарственную устойчивость за счет продукции различных вариантов b-лактамаз - ферментов, разрушающих b-лактамные антибиотики, либо за счет модификации пенициллин-связывающих белков (ПСБ), являющихся мишенями действия для b-лактамных антибиотиков.

     Результаты научных исследований указывают на необходимость определения чувствительности перед назначением антимикробной терапии. Знание бактериальной резистентности к антибиотикам имеет важное значение для успешной борьбы с болезнью.

     Назначение несвоевременной и неадекватной терапии внутрибольничных и тяжелых инфекций увеличивает вероятность летального исхода. Поэтому очень важно на ранних стадиях заражения выявить тип антибиотикорезистентности, чтобы подобрать адекватную схему лечения и использовать наиболее эффективные антибактериальные препараты. В случае тяжелых инфекций это нужно сделать в кратчайшие сроки.

     В отличие от традиционных микробиологических методов, метод ПЦР позволяет проводить идентификацию генетических детерминант резистентности микроорганизмов, в том числе сложно культивируемых бактерий, в течение 4 часов. Он отличается высокой точностью и меньшими требованиями к забору материала, не требует наличия питательных сред, дисков с антибиотиками и дополнительных реактивов. Определение антибиотикорезитентности с помощью ПЦР позволяет спрогнозировать появление устойчивости к различным группам антимикробных препаратов, а также оценить распространение резистентных штаммов на локальном и региональном уровнях. Поэтому обнаружение антибиотикорезистентности методом ПЦР является отличным дополнением к традиционному микробиологическому тестированию.

     В современной клинической практике можно выделить несколько вариантов антибактериальной резистентности, приводящих к крайне серьезным социально-экономическим последствиям. К таким вариантам относятся:

  • устойчивость к b-лактамным антибиотикам среди грамотрицательных бактерий, в частности Enterobacteriaceae и P.aeruginosa, связанная с продукцией ?-лактамаз;
  • устойчивость к гликопептидам среди Enterococcus spp.;
  • устойчивость к b-лактамным антибиотикам среди Staphylococcus aureus;
  • устойчивость к фторхинолонам среди грамположительных и грамотрицательных бактерий;
  • устойчивость к макролидам среди Streptococcus spp.

     Большинство из перечисленных вариантов обусловлено приобретением бактериями данной группы той или иной генетической детерминанты устойчивости (таблица 1), обнаружение которой возможно с помощью ПЦР.

Таблица 1

 

 

    В ООО НПФ «Литех» разработана серия ПЦР-наборов для обнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.

    Грамотрицательные бактерии, в том числе возбудители нозокомиальных инфекций, как правило, реализуют устойчивость к b-лактамным антибиотикам за счет продукции многочисленных b-лактамаз, при этом один штамм может продуцировать несколько различных ферментов. Продуцируемые бактериями ферменты различны по своей субстратной специфичности, среди них выделяют следующие типы:

  • пенициллазы, гидролизующие только пенициллин и ампициллин;
  • бета-лактамазы расширенного спектра действия (ESBL), гидролизующие пенициллины и цефалоспорины;
  • металло-бета-лактамазы, или карбапенемазы, гидролизующие пенициллины, цефалоспорины и карбапенемы.

    Генотипирование на основе ПЦР остается золотым стандартом детекции и идентификации b-лактамаз, в том числе металло-b-лактамаз.

Необходимость обнаружения генов blaSHV, blaTEM, ответственных за продукцию пенициллаз, или b-лактамаз узкого спектра действия (NSBL)

    Штаммы, продуцирующие b-лактамазы узкого спектра действия (NSBL), обычно вырабатывают TEM-1 и/или SHV-1 ферменты, которые разрушают пенициллины и ранние цефалоспорины, но чувствительны к другим классам b-лактамных антибиотиков. Мутации в промоторном участке гена TEM-1 могут привести к гиперпродукции этих ферментов. Подобная гиперпродукция может обернуться устойчивостью к другим b-лактамным антибиотикам, помимо пенициллина. Точечные мутации в этих ферментах могут привести к возникновению устойчивости к ингибиторам b-лактамаз, например, сульбактаму и клавулановой кислоте. Устойчивые штаммы особенно опасны при лечении инфекций у детей, когда препаратами выбора являются пенициллины и ранние цефалоспорины. При неадекватной терапии существует риск перехода заболевания в хроническую форму.

Для обнаружения генов устойчивости к пенициллинам и ранним цефалоспоринам разработаны следующие наборы:

      • Резистентность к пенициллинам – 1

Резистентность Enterobacteriaceae и Pseudomonas к пенициллинам и ранним цефалоспоринам. (Гены TEM)

      • Резистентность к пенициллинам - 2

Резистентность Enterobacteriaceae к пенициллинам и ранним цефалоспоринам. (Ген SHV-не ESBL)

 

      Необходимость обнаружения генов, ответственных за продукцию ?-лактамаз расширенного спектра действия (ESBL)

     Среди грамотрицательных бактерий гены blaSHV, blaTEM, blaCTX и blaAMPC, встречающиеся у E. coli, K. pneumoniae и Acinetobacter spp, кодируют ?-лактамазы расширенного спектра (ESBL) и чаще всего располагаются на плазмидах. ESBL - это ?-лактамазы, способные гидролизовать все пенициллины и цефалоспорины за исключением цефамицина, моксалактама и карбапенемов. Варианты blaSHV, blaTEM, устойчивые к широкому спектру антибиотиков, образовались в результате мутаций генов TEM-1 и SHV-1. Наиболее часто встречаются CTX-M - продуцирующие грамотрицательные палочки. Во всем мире отмечается, что изоляты E.coli, продуцирующие ферменты типа CTX-M (особенно CTX-M-15), являются важной причиной инфекций мочевыводящих путей и инфекций крови.

Для обнаружения устойчивости энтеробактерий к цефалоспоринам разработан набор:

      • Резистентность к цефалоспоринам - 1

Резистентность Enterobacteriaceae к цефалоспоринам. (Гены CTX-M)

 

      Необходимость обнаружения генов, ответственных за продукцию металло-бета-лактамаз, или карбапенемаз 

    Карбапенемы, главным образом имипенем и меропенем, являются основными агентами в борьбе с грамотрицательными палочками, обладающими множественной лекарственной устойчивостью. В этой связи распространение грамотрицательных бактерий, продуцирующих карбапенемазы, представляет серьезную проблему в сфере здравоохранения. С 2009 года Национальная референсная лаборатория Германии отслеживает молекулярную эпидемиологию карбапенемаз грамотрицательных нозокомиальных патогенов. В 2011 среди 1454 бактериальных изолятов устойчивость к карбапенемам была обнаружена у 34,4% штаммов Enterobacteriaceae, 19,9% штаммов Pseudomonas aeruginosa и в 96,3% изолятов Acinetobacter baumannii.

    Карбапенем-устойчивые Enterobacteriaceae резистентны почти ко всем антибиотикам и в 40% случаев приводят к смерти пациента. В США за 2009-2010 годы в 13% случаев инфекций кровотока и катетер-ассоциированных инфекций мочевыводящих путей, вызванных Klebsiella, возбудитель был устойчив к карбапенемам. Для E.coli этот показатель составил около 2%. Наиболее частыми карбапенемазами среди Enterobacteriaceae являются OXA-48, KPC и VIM-1, у Pseudomonas aeruginosa - VIM-2. Продуцирующие их гены расположены на интегронах и могут легко встраиваться в плазмиды или хромосомы. Таким образом, довольно просто происходит обмен этими генами как внутри бактериальной популяции одного вида, так и между различными видами (например, Pseudomonas может обмениваться генетической информацией как с другими Pseudomonas, так и с другими грамотрицательными палочками). Для многих ферментов (GIM, VIM, SPM и IMP) до сих пор не разработаны ингибиторы.

    Распространение NDM-1 гена, кодирующего Нью-Дели металло-b-лактамазу (NDM-1) в Enterobacteriaceae, является одной из основных проблем глобального здравоохранения. Продукт гена NDM-1 способен гидролизовать практически все b-лактамные антибиотики и в сочетании с другими механизмами резистентности делает бактерию устойчивой почти ко всем антибиотикам. Первоначально плазмиды, кодирующие blaNDM-1, были обнаружены у  Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli. Посредством конъюгации плазмиды могут передаваться и другим видам. Недавно blaNDM-1 были обнаружены в Acinetobacter baumannii и Vibrio cholerae.

    NDM ферменты, такие как NDM-4, сейчас эволюционируют в более каталитически активные варианты.

    Инфекции крови, вызванные  OXA-48-продуцирующими Enterobacteriacea, имеют плохой прогноз, поскольку часто происходит задержка между постановкой диагноза и началом адекватной терапии.

    Обнаружение способности продуцировать металло-b-лактамазы различными представителями грамотрицательных бактерий, оценка масштабов встречаемости кодируемых их генов в клинических образцах важны для предотвращения распространения инфекции и проведения адекватной этиологической терапии пациентов.

    Задачу обнаружения генов, кодирующих карбапенемазы, решают следующие наборы:

     • Резистентность к карбапенемам - 1

    Резистентность Enterobacteriaceae и Pseudomonas к карбапенемам. (Гены VIM)

     • Резистентность к карбапенемам - 2

    Резистентность Enterobacteriaceae к карбапенемам. (Гены NDM)

     • Резистентность к карбапенемам - 3

     Резистентность Enterobacteriaceae к карбапенемам. (Гены OXA-48)

 

     Грамположительные бактерии, как правило, реализуют устойчивость к b-лактамным антибиотикам за счет модификации пенициллин-связывающих белков (ПСБ), являющихся их мишенями действия. В частности, стафилококки способны синтезировать ПСБ2а, обладающий сниженной аффинностью к пенициллинам (метициллину и оксациллину) и цефалоспоринам. Способность к продукции такого белка кодируется геном MecA, передающимся в популяции в составе мобильной хромосомной кассеты.

      Золотистый стафилококк способен поражать практически любые ткани организма человека, вызывая пневмонии, сепсис, остеомиелиты, маститы, инфекции кожи и тканей, мочевыводящих путей и др. Наличие гена MecA у S. aureus обуславливает его “метициллин - резистентность” – устойчивость к цефалоспоринам, часто сопровождающуюся множественной устойчивостью к другим классам антибиотиков. Устойчивые штаммы, обозначаемые как MRSA, часто выявляются при заражении крови и осложненных инфекциях мочеполовой системы. При лечении инфекций кожи и мягких тканей, особенно в развивающихся странах, метициллин-резистентный золотистый стафилококк нельзя сбрасывать со счетов.

      Для обнаружения метициллин - резистентных штаммов золотистого стафилококка предназначен набор:

      • Резистентность к цефалоспоринам- 2

      Резистентность S. aureus к b-лактамным антибиотикам. (Ген MecA)

 

      Гликопептидные антибиотики - ванкомицин и тейкопланин в терапии энтерококковых инфекций

    Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium являются причиной 85-90% энтерококковых и третьей по частоте причиной внутрибольничных инфекций, особенно бактериемии, сепсиса у детей, эндокардита, инфекций мочевыводящих путей. Большинство больничных изолятов энтерококков устойчивы к обычным антибиотикам, устойчивость к ванкомицину достигает 40% популяции. Два гена резистентности (VanА и VanB) являются наиболее распространенными, особенно среди E. faecium. Штаммы с VanА геном устойчивы к ванкомицину и тейкопланину, штаммы с VanB устойчивы к ванкомицину, но сохраняют чувствительность к тейкопланину.

     Ванкомицин-устойчивые энтерококки (VRE) являются важными этиологическими агентами внутрибольничных инфекций. Частота обнаружения VRE особенно высока в отделениях интенсивной терапии новорожденных в связи с иммунной недостаточностью у новорожденных, частым использованием антибиотиков и длительного срока госпитализации.

     По данным последних публикаций метод ПЦР является наиболее быстрым и чувствительным методом для одновременного обнаружения энтерококков и определения их резистентности к ванкомицину. Среднее время проведения ПЦР и стандартного микробиологического исследования занимает 10 часов и 5 дней, соответственно.

     Для выявления устойчивости энтерококков к гликопептидным антибиотикам разработан набор:

      • Резистентность к гликопептидам

Резистентность E. faecalis и E. faecium к ванкоминицу и тейкопланину. (Фенотипы VanA и VanB).

Использование ПЦР - наборов ООО НПФ “Литех” позволяет быстро и качественно выявлять генетически обусловленную устойчивость микроорганизмов к антибиотикам и способствует выбору адекватной лекарственной терапии.





© 2009-2015 OOO «Лабораторные технологии»
Телефон/факс : +7 (342)291-21-91, 205-52-90
E-mail: labt1@yandex.ru