Медицинские статьи
Новости для специалистов

Коммерческие предложения
Документация
Медицинские статьи
Нормативные документы
Ссылки на статьи в мед изданиях

Прокальцитонин-маркер диагностики тяжелой инфекции

Прокальцитонин — новый маркер для диагностики тяжелой инфекции

 

Вот уже несколько десятилетий сепсис и тяжелые инфекции остаются одной из актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту числа больных и стабильно высокой летальности, несмотря на использование новых принципов и методов лечения.

Это часто происходит из-за отсроченной постановки диагноза и начала лечения, а также из-за отсутствия возможности точно оценить эффективность лечения. Поэтому проблема своевременной диагностики сепсиса и эффективного контроля течения заболевания стоит в настоящее время достаточно остро.
В клинической практике существуют две основные проблемы при диагностировании тяжелой инфекции:

  • Первая – это дифференцирование между инфекцией per se, то есть локальной, и генерализованной инфекцией сопровождающейся соответствующими системными реакциями. Патофизиологические эффекты синдрома системного воспалительного ответа (ССВО) могут быть определены клинически по наличию признаков, но тяжесть синдрома и прогноз клинически оценить гораздо труднее.
  • Вторая проблема при диагностировании сепсиса – это дифференцирование между инфекционной и другими причинами синдрома системного воспалительного ответа, такими как травма и иммунокомплексные заболевания. Диагностика затруднена также тем, что у большой части пациентов с явной клинической картиной сепсиса, гемокультура часто бывает отрицательной.


Воспаление, возникающее после какой-либо формы тканевого повреждения, сопровождается продукцией цитокинов и белков острой фазы, определение которых может говорить о наличии воспаления и степени его тяжести. В некоторых случаях определение белков острой фазы или цитокинов может свидетельствовать о природе воспалительного процесса или его осложнениях, хотя воспалительные процессы в целом очень схожи, независимо от причины. В этой связи понятен интерес исследователей и клиницистов к прогормонам Кальцитонина и, прежде всего к прокальцитонину (РСТ), который, как считают некоторые исследователи, является специфическим маркером инфекции.

 КЛИНИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ПРОКАЛЬЦИТОНИНА

Определение уровней РСТ в сыворотке и плазме крови по данным разных авторов может быть полезным в следующих ситуациях :


• В качестве диагностики сепсиса, септического шока и тяжелых бактериальных инфекций. Для дифференциального диагноза инфекционной и неинфекционной этиологии лихорадки неясного генеза.
• Для мониторинга состояния больных с сепсисом, шоком; оценки эффективности проводимого лечения; оценки прогноза для данного больного.
• PCT подходит для ранней диагностики инфекционных осложнений :
1. Хирургических пациентов 
2. Пациентов интенсивной терапии 
3. Реципиентов после пересадки 
4. Пациентов на искусственной вентиляции 
5. Пациенты с иммуносуперссией
6. Пациенты с нейтропенией
7. Пациенты с заболеваниями неясного генеза
• PCT можно ииспользовать для дифференциального диагноза:
1. Инфекционной и неинфекционной этиологии (например. ОРДСВ, острого панкреатита) 
2. Бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний (например острого менингита, сепсиса новорожденных) 
3. Острых бактериальных инфекций и хронических воспалительных процессов например аутоиммунных заболеваний 
4. Реакций против трансплантанта и инфекционных осложнений бактериальной и грибковой природы 
• Уровни РСТ повышаются также при тяжелой пневмонии, перитоните, бактериальном менингите.
• Кроме того, уровни РСТ могут повышаться при малярии, мелиодозе, системных грибковых инфекциях.

Прокальцитонин был впервые описан в 1984 году как белок, состоящий из 116 аминокислот и имеющий молекулярную массу 14.5 кDa. Первоначально РСТ привлек внимание исследователей в качестве возможного маркера злокачественных новообразований. Bohuon с соавторами в институте G. Roussy изучали кальцитонин как маркер медуллярного рака щитовидной железы и параллельно начали изучать информативность предшественников кальцитонина, для чего были получены моноклональные антитела к РСТ и разработан радиоиммунометрический тест для определения его концентрации. Эта же группа исследователей выявила, что концентрации прокальцитонина повышены у больных с мелко-клеточной карциномой легкого, что свидетельствовало о том, что РСТ вырабатывается не только в щитовидной железе. 
С начала 1990-х к прокальцитонину приковано внимание исследователей, которые пытаются выяснить – является ли он специфическим маркером инфекции. Впервые данные о повышении концентрации РСТ в крови при воспалении были получены группой французских военных врачей (Dr. Carsin и др.), которые изучали маркеры острого повреждения легкого, у больных с обширными ожогами. В качестве потенциально полезного маркера в исследовании также изучался РСТ и было выявлено, что концентрации его были во многих случаях значимо повышены и часто были во много раз выше, чем концентрации при новообразованиях. Ретроспективный анализ выявил, что у больных с наиболее высокими уровнями РСТ в крови, развились инфекционные осложнения, в том числе сепсис и септический шок. Такие результаты впервые позволили установить взаимосвязь между уровнем РСТ в крови и наличием системного воспаления.
Следующим было исследование уровней РСТ в крови у детей с менингитом. Было обнаружено, что уровень РСТ заметно повышен у детей с бактериальным, а не вирусным менингитом, после чего данные были опубликованы. В дальнейшем большое количество исследователей в разных странах изучали роль прокальцитонина в качестве маркера тяжелой инфекции, а также как медиатора системного воспаления.
Первоначально, РСТ мог быть получен только в небольших количествах путем сложного синтетического процесса. В настоящее время на материале E. Coli получен рекомбинантный РСТ, разработаны чувствительные и специфичные методы измерения концентрации РСТ.

ФУНКЦИИ ПРОКАЛЬЦИТОНИНА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

В нормальной физиологии, единственная роль, установленная для PCT – это роль предшественника кальцитонина. Кальцитонин, как известно, регулирует метаболизм костей и кальция, а также ингибирует резорбцию кости остеокластами. Ранее предполагали, что кальцитонин (CT), названный так за гипокалиемический эффект, имеет исключительно тиреоидное происхождение и играет важную роль в скелетном гомеостазе. Однако было выявлено, что при тиреоидектомии у людей не происходит никаких значительных патологических последствий в отношении гомеостаза кальция, и плотность костей в большинстве случаев остается прежней. Таким образом, физиологические функции зрелого CT у человека пока еще остаются неизвестными, не были также до сих пор определены нарушения, которые возникают в организме при избытке или дефиците зрелого кальцитонина.

По традиционным представлениям в эндокринологии, предшественники кальцитонина вырабатываются главным образом в нейроэндокринных C-клетках щитовидной железы. В отсутствие инфекции, экстратиреоидная транскрипция CALC-I гена подавлена и огранивается селективной экспрессией в нейроэндокринных клетках, обнаруживаемых главным образом в щитовидной железе и легком. В этих нейроэндокринных клетках синтезируется зрелый гормон и запасается в секреторных гранулах.
При тяжелой системной инфекции, прокальцитонин продуцируется тканями вне щитовидной железы. Это подтверждается тем, что у пациентов, которые предварительно подверглись тотальной тиреоидектомии все равно, продуцируются высокие уровни прокальцитонина в течение тяжелой инфекции. Кроме тканей щитовидной железы РСТ продуцируется атипичными клетками мелкоклеточной карциномы легкого. 
Кальцитонин и родственные пептиды обнаруживаются у человека в нейроэндокринных клетках легкого. Было выявлено, что м-РНК прокальцитонина экспрессируется у человека в мононуклеарах периферической крови, а липополисахарид оказывает на эту экспрессию заметный стимулирующий эффект.
 Моноциты, выделенные из крови больных с септическим шоком показывали более высокий базальный уровень и увеличение содержания РСТ в ответ на стимуляцию липополисахаридом. Примерно треть нестимулированных лимфоцитов содержат иммунологически демонстрируемые количества РСТ, однако в данном случае было отмечено лишь незначительное индуцирование синтеза бактериальным липополисахаридом. В других исследованиях периферические мононуклеары крови не демонстрировали выработки РСТ в ответ на стимуляцию липополисахаридом. Причины таких расхождений пока не известны. Инкубация срезов человеческой печени с интерлейкином-6 и фактором некроза опухоли альфа демонстрировали увеличение концентрации РСТ более чем в 2 раза, в то время, как концентрации протеина сывороточного амилоида А (SAA) и С-реактивного протеина (CRP) увеличивались лишь умеренно и только в ответ на стимуляцию ФНО-?. Возможно также острофазовое происхождение в печени.
Некоторые авторы считают, что микробная инфекция стимулирует повсеместное увеличение экспрессии CALC-I гена и индукцию CTпр во всех тканях и типах клеток организма. Таким образом, при септических состояниях весь организм может рассматриваться как эндокринная железа. Установлено, что транскрипционная экспрессия CT-мРНК более стабильно индуцируется при сепсисе, чем м-РНК классических цитокинов (например. TNF-a и IL-6). Наибольшая индукция СТпр м-РНК и выделение CTпр пептидов происходит в паренхиматозных клетках, а не в циркулирующих клетках, что возможно указывает скорее на тканевые механизмы защиты, чем на лейкоцитарные, поэтому была предложена гипотеза, что продукты CALC-генов являются прототипами гормокиновых медиаторов и могут индуцироваться как классической гормональной экспрессией так и, альтернативно, путем цитокино-подобной экспрессии. Продукция гормокинов индуцируется неизвестными пока еще факторами и может быть вызвана как непосредственно воздействием микробных токсинов так и косвенно, через гуморальный или клеточный ответ хозяина. При сепсисе, Спр являются продуктом физиологичного синтеза, а доминирование CTпр по отношению к зрелому CT является следствием преобладания клеток, испытывающих недостаток секреторных гранул и следовательно требующих значительной ферментной обработки. Следовательно, как и большинство цитокинов, СТпр накапливаются внутриклеточно лишь в очень небольшом количестве при сепсисе.
Weglohner и др. исследовали первичную структуру сывороточного PCT у пациентов с сепсисом. Были собраны сыворотки, содержащие высокие концентрации PCT (> 100 ng/ml) от 22 пациентов с тяжелым сепсисом и были объединены для дальнейшей очистки. Объединенный PCT был очищен на CT 21-иммуноаффинной колонке, затем очищен обратной фазой HPLC, и полученный чистый PCT был обработан эндопротеиназой Asp-N. Отщепление N-терминала показало, что первые две аминокислоты (Ala-Pro) в изучаемом пропептиде отсутствовали. Было продемонстрировано, что PCT в сыворотке пациентов с сепсисом является пептидом, состоящим только из 114 аминокислот, вместо 116 аминокислот, что связано с недостатоком в N-терминале дипептида Ala-Pro.
Также как и у людей, у хомяков при сепсисе увеличиваются уровни CTпр. В исследовании Nylen с соавт. сепсис индуцировался у хомяков внутрибрюшинным введением шариков, содержащих 5 x l08 кфе Escherichia coli. Во время внедрения шарика, животным вводилось также 3 мг человеческого РСТ или эквивалентный объем альбумина сыворотки. Они наблюдались в течение 72 часов. При этом исследовалась смертность в качестве первичного показателя исхода. В результате, у контрольных животных с перитонитом и получивших альбумин смертность через 48 часов составила 50 %, а смертность к 72 часам — 56 %. У экспериментальных животных с перитонитом, которым ввели РСТ смертность через 48 часов составила 87 % (p < 0.03), и 94 % через 72 часа (p < 0.02). РСТ, назначаемый в отсутствии перитонита и сепсиса не влиял на смертность. Эти наблюдения, как считает автор, удовлетворяют критериям Koch-Dale для РСТ как причинного медиатора сепсиса.
Гипокальциемия и увеличение уровней в сыворотке CTпр — обычные результаты, которые обнаруживаются у пациентов интенсивной терапии, особенно у пациентов с инфекцией и сепсисом. Действительно, гипокальциемия чаще отмечается с увеличением тяжести инфекции, и происходит параллельно с отмеченным увеличением CTпр. Напротив, как было упомянуто выше, сывороточные уровни зрелого CT остаются нормальными или только минимально увеличиваются при сепсисе. Однако не все авторы согласны с тем, что при тяжелых инфекциях РСТ влияет на обмен кальция. В их наблюдениях высокий уровень РСТ в крови не был связан с гипокальциемией.
Функции, которые РСТ выполняет при сепсисе остаются в целом неясными. Было показано, что РСТ ингибирует синтез простагландинов и тромбоксанов в лимфоцитах in vitro и подавляет липополисахарид(LPS)-зависимую стимуляцию продукции TNF в цельной крови. Большинство исследователей считают, что прокальцитонин вносит вклад в достаточно вредные эффекты системной воспалительной реакции. 
Дальнейшие, эксперименты продемонстрировали, что иммунонейтрализация РСТ является эффективным методом снижения летальности экспериментальных животных, даже когда они находятся в критическом состоянии. Исследования показали, что улучшение вероятно связано с иммунонейтрализацией целой молекулы PCT. Несколько характеристик РCT свидетельствуют о потенциальной ценности этого медиатора как цели для терапевтического воздействия при сепсисе. В отличие от классических цитокинов, уровень которых в сыворотке повышается кратковременно и для которых исследования по иммунонейтрализации показали неудовлетворительные результаты, массивное повышение CTпр в системной циркуляции сохраняется в течение многих дней. Кроме того, высокие уровни CTпр достаточно специфичны для сепсиса и отмечаются достаточно рано (в пределах 3 часов). Следовательно диагностическая точность измерения должна значительно улучшить отбор пациентов для любого изучения терапевтической эффективности иммунонейтрализации PCT у людей.
Относительно того, является ли прокальцитонин ключевым медиатором при сепсисе, ответ, по мнению специалистов, скорее всего отрицательный. PCT — определенно не является инициирующим и завершающим фактором этого состояния. Но при этом, РСТ кажется, чрезвычайно важным посредником, иммунонейтрализация которого представляет существенные терапевтические возможности. Молекулярные исследования и исследования на животных только начинают расшифровывать патофизиологические механизмы действия СТпр при сепсисе. При этом состоянии, повышаются уровни нескольких CTпр, включая ProCT, N-ProCT, CT:CCP-I, незрелый CT, и CCP-I, любой из которых может иметь агонистические, антагонистические, или нейтральные эффекты.
В исследовании Zeni и др., которое проводилось на нескольких пациентах, было показано, что уровни РСТ тесно корреллируют с уровнями TNF-?, IL-6 и IL-8. Здоровые добровольцы, которым внутривенно вводили эндотоксин Escherichia coli, почувствовали недомогание через 1 час после инъекции, через 1 – 2 часа у них появилась лихорадка, они стали ощущать озноб и миалгию. Уровни прокальцитонина, не обнаруживались сразу после введения, начали увеличиваться через 4 часа после введения и стабилизировались на уровне 4 нг/мл между 8-24 часами. Пиковые концентрации TNF и IL-6 отмечались через 90 и 180 минут, соответственно, после введения эндотоксина и не обнаруживались через 24 часа. Повышение уровней PCT после внутривенного введения бактериального эндотоксина происходит после повышения уровней TNF-a и IL-6. TNF-a и IL-6 достигают своих пиковых концентраций приблизительно к 90 и 180 минутам, соответственно, после введения эндотоксина. Схожие результаты отмечал Assicot и др., также применяя внутривенное введение эндотоксина здоровым добровольцам. Уровни PCT в последнем исследовании начинали повышаться через 3 — 6 часов после введения эндотоксина и достигали максимума приблизительно через 6 — 8 часов. Из-за продолжительного времени полувыведения PCT, пиковые концентрации обнаруживаются в промежуток между 12 и 48 часами и выглядят не как пик, а в виде плато. В период между 48 и 72 часами показатели начинают снижаться. Однако, при повторных введениях эндотоксина, первоначально повышенные уровни PCT значимо не увеличивались, и повторные введения не препятствовали снижению уровня РСТ через 72 часа после первого введения.
Тот факт, что уровни РСТ повышаются следом за уровнями провоспалительных цитокинов, дает основание предполагать, что продукция РСТ при системном воспалении стимулируется этими цитокинами. Так, в модели сепсиса на хомяках, PCT не инициировал увеличение экспрессии IL-1a или TNF-А, однако, массивное и постоянное повышение этого гормона, отмечаемое при сепсисе может быть вызвано у здоровых хомяков после введения цитокина TNF-a. Это может означать, что PCT может быть вторичным медиатором, который может увеличивать ответ при сепсисе. Это также относится и к онкологическим больным, при лечении которым вводят рекомбинантный человеческий (rh) TNF-? или мелфалан путем изолированной дисковой перфузии либо rh IL-6 внутривенно или подкожно. Уровень РСТ в плазме увеличивался через 3 – 5 часов после перфузии rh TNF, достигал своего пика к 8 часам, в то время как уровни CRP и SAA достигали половины максимального уровня только к 20 часам. Ответ РСТ на IL-6 был менее драматичным и более медленным. В другом исследовании по применению мелфалана и РСТ путем изолированной дисковой перфузии были получены схожие результаты, причем было выявлено, что мелфалан изолированно вызывал лишь незначительный ответ. Кроме того, было выявлено, что уровни IL-6 и IL-8 также повышаются после перфузии rh TNF и достигают пика на несколько часов ранее РСТ. Из этого авторы считают возможным заключить, что повышение уровней РСТ в сыворотке регулируется прямо или опосредовано цитокинами TNF и IL-6. C-реактивный белок (CRP) и сывороточный амилоид А (SAA) продуцируются на те же стимулы, но более медленно. Однако описаны состояния при которых повышение уровня IL-6 не сопровождалось повышением уровней прокальцитонина (например после некоторых хирургических вмешательств), что говорит за то, что IL-6 и прокальцитонин регулируются независимо друг от друга.
Применение IL-2 может также стимулировать выброс PCT. Так быстрый выброс РСТ одновременно с TNF-? и IL-6 наблюдалось у пациентов с раком почки после внутривенного введения IL-2. Введение IL-3, не стимулировало PCT или TNF-a, но стимулировало IL-6. Следовательно, бактериальные эндотоксины и, по всей видимости, TNF-a наиболее значимо индуцируют PCT в экспериментальных условиях in vivo.
При подостром и хроническом воспалении, уровни PCT, IL-6 и CRP часто следуют параллельным курсом. По сравнению с цитокинами для РСТ, однако, обычно не наблюдаются механизмов снижающих его уровни. Это может быть одной из причин, почему PCT хорошо корреллирует с клиническим состоянием пациента, и поэтому подходит для контроля течения болезни.

ДОСТУПНЫЕ МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ

Bohuon с соавт., которые впервые выявили способность РСТ повышаться в организме при микробной инфекции разработали достаточно чувствительный и специфичный тест для определения уровня кальцитонина в сыворотке, используя моноклональные антитела.

Параллельно с этим, они разработали также библиотеку моноклональных антител, которые определяли не только кальцитонин, но также РСТ, а также N- или С- терминал молекул предшественников кальцитонина, кальцитонинового глицина, катакальцина.

Основной проблемой в то время было получение чистого РСТ, что необходимо для стандартизации измерений. Ghillani и др. также разработали специфический тест с моноклональными антителами против остатка РСТ 96 – 106 в качестве основного антитела и против остатка 70 – 76 в качестве метки, которая выявляла только интактный РСТ. Участок 70 – 76 является частью молекулы кальцитонина, в то время как 96 – 106 — это участок молекулы катакальцина.

На сегодняшний день коммерчески доступными является только тесты фирмы Brahms Diagnostica, Berlin, Germany к которым относятся полуколичественный тест Brahms PCT-Q, иммунолюминометрические тесты Brahms Lumitest-PCT, Brahms LIAISON-PCT и Brahms CRYPTOR-PCT.
Brachms PCT-Q - это иммунохроматографический тест для полуколичественного определения PCT (прокальцитонина), который используется для диагностики и контроля проводимой терапии острых бактериальных инфекций и сепсиса. Brachms PCT-Q — это тестовая система с периодом инкубации 30 минут, которая не нуждается в калибровке и в дополнительной аппаратуре. Тест основан на использовании моноклональных мышиных анти-катакльциновых антител, конъюгированных с коллоидным золотом (метка) и поликлональных антикальцитониновых антител (плотная фаза). 
LUMItest ® PCT - иммунолюминометрический тест, который может быть использован для количественного определения концентрации PCT в человеческой сыворотке и плазме. Два антиген-специфичных моноклональных антитела, которые связывают PCT (антиген) на двух различных участках (катакальциновый и кальцитониновый сегменты) используются в этом тесте в избыточных количествах. Один из этих антител — люминисцентно маркирован (метка), а другой фиксирован к внутренней поверхности пробирки. В течение инкубации, оба антитела реагируют с молекулами PCT в исследуемой пробе, и формируют “сэндвичный комплекс”. В результате люминесцентно-маркированные антитела, связываются со внутренней поверхностью пробирки. Как только реакция заканчивается, избыток маркированных антител полностью удаляется из пробирки. После этого, остаточное количество метки на тестовой поверхности пробирки определяется количественно при помощи измерения сигнала люминесценции, используя для этого люминометр и LUMItest ® Basiskit реактивы. Интенсивность сигнала люминесценции (RLU) прямо пропорциональна концентрации РСТ в образце. 
LIAISON ® BRAHMS PCT
 ® - иммунолюминометрический двухучастковый тест (принцип сэндвича). Два различных высоко специфичных моноклональных антитела используются для покрытия твердой фазы (магнитные частицы) и для метки. В течение первой инкубации, PCT присутствующий в исследуемой пробе и калибраторы связываются с маркированными антителами. В течение второй стадии инкубации, антитела твердой фазы реагируют с уже связанным РСТ. Избыток метки удаляется циклом вымывания. После этого добавляются реактивы стартера добавлены. Концентрация РСТ в образце и калибраторах измеряется путем индуцированной реакции хемилюминисценции. Слабый сигнал измеряется и интенсивность его прямо пропорциональна концентрации прокальцитонина в образце. KRYPTOR ® использует технологию TRACE, основанную на нерадиоактивной передаче энергии. Эта передача имеет место между двумя флюоресцентными метками: еуропиум криптат (донор) и XL665 (акцептор). Сигнал, измеренный во время формирования комплекса антиген-антитело подвергается усилению. Тест KRYPTOR ® гомогенен, без процедур разделения или отмывания. Таким образом возможно получить данные без прервания иммунологической реакции. Высокая концентрация РСТ в исследуемые образцы обнаруживается в течение первых нескольких секунд инкубации. Такие пробы могут разводиться соответствующим раствором, после этого автоматически ре-анализироваться.





© 2009-2015 OOO «Лабораторные технологии»
Телефон/факс : +7 (342)291-21-91, 205-52-90
E-mail: labt1@yandex.ru