Медицинские статьи
Новости для специалистов

Коммерческие предложения
Документация
Медицинские статьи
Нормативные документы
Ссылки на статьи в мед изданиях

Лаб диагностика бак инфекций мочевыводящих путей

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) широко распространены среди насе­ления. Так, в Западной Европе их ежегодно диагностируют в среднем у 4% на­селения. У женщин заболевание регистрируют в 30 раз чаще, чем у мужчин, причем с возрастом частота ИМП увеличивается: у девочек школьного возраста она составляет в среднем 1%, к 30 годам возрастает до 20% и достигает макси­мального уровня после 60 лет. Среди мужчин к ИМП наиболее предрасположе­ны мальчики до 5 лет и пожилые люди, но даже у последних инцидентность поражения мочевыводящих путей не превышает 5%. Практически всегда на­званная патология возникает у пациентов с мочевыми катетерами. В целом на долю ИМП приходится около 40% госпитальных инфекций, причем чаще всего причиной становится применение уретральных катетеров.

Этиология инфекций мочевыводящих путей

     С удивительной закономерностью по всему миру у различных половозраст­ных групп населения при наиболее тяжело протекающих ИМП наиболее часто изолируют из мочи кишечную палочку (E. coli) и сапрофитный стафилококк (S. saprophyticus), относимые в соответствии с этим Европейской конфедераци­ей лабораторной медицины (European Confederation of Laboratory Medicine -ECLM) к первичным возбудителям ИМП человека. Многие бактерии, ассоциированные с ИМП, проявляют патогенные свой­ства значительно реже или преимущественно на фоне других инфекций, ослаб­ления иммунитета, инвазивных диагностических и лечебных процедур. К числу таких условно патогенных видов относятся клебсиеллы, ацинетобактеры, энте-робактеры, протеи, морганеллы, серратии, псевдомонады, стрептококки груп­пы В, энтерококки, коринебактерии и ряд других микроорганизмов.

    Обе упомянутые выше группы микроорганизмов относят к типичным воз­будителям ИМП. Помимо них при бактериологическом исследовании мочи в ряде случаев выявляют нетипичных возбудителей, которые обычно ассоции­рованы с инфекциями других органов и тканей, а мочевой тракт поражают спо­радически. Поэтому такая находка должна каждый раз внимательно изучаться, перепроверяться и анализироваться, чтобы не стать причиной диагностиче­ской ошибки.

Клиническое значение бактериурии

     В одних случаях ИМП протекают бессимптомно, в других принимают раз­ные клинические формы, исход которых во многом определяется своевремен­ностью выявления, точностью идентификации и чувствительностью этиологи­ческого агента к антимикробным препаратам. Их симптоматика варьирует в зависимости от локализации возбудителя в нижних (уретрит и цистит) или верхних (пиелонефрит) отделах мочевого тракта. При уретрите обычно отмеча­ют дизурию и поллакиурию, при цистите — боли в нижней части живота, уча­щенное мочеиспускание, транзиторную гематурию, изменение запаха мочи; при остром пиелонефрите — боли в поясничной области, положительный син­дром Пастернацкого, повышение температуры тела, озноб, гематурию, лейкоцитурию, в ряде случаев протеинурию, а также комплекс неспецифических на­рушений (тошноту, рвоту, диарею).

     Обнаружение в моче микроорганизмов не всегда позволяет установить эти­ологию болезни. Чтобы иметь для этого основания, необходимо в первую оче­редь подтвердить постоянное присутствие агента в мочевом тракте пациента в течение периода наблюдения. Это достигается посредством его обнаружения в повторно взятых пробах мочи или в образцах, полученных катетеризацией или пункцией мочевого пузыря, что значительно снижает вероятность случайной контаминации.

     Важнейшим критерием «истинной» ИМП служит высокая концентрация (титр) агента в моче. Е.Х. Касс в 1960 г. установил, что в бессимптомный период развития пиелонефрита в моче 95% женщин титр возбудителя превышает 105 КОЕ/мл. Пользуясь этим индикатором, получившим название «критерия Касса», урологи на протяжении полувека классифицируют бактериурию на «ис­тинную» и «случайную», порой забывая, что данный параметр был определен только для одной группы пациентов (женщин) с определенной патологией (острый пиелонефрит). Более глубокое изучение данного вопроса показало, что такой диагностический уровень бактериурии часто является завышенным, т. е. служит причиной невыявления большого числа ИМП. По мнению специали­стов Европейской конфедерации лабораторной медицины, диагностический титр первичных возбудителей ИМП, обнаруженных в собранной при есте­ственном мочеиспускании пробе мочи, должен быть не менее 103 КОЕ/мл, а дру­гих бактерий — больше или равным 104 КОЕ/мл (для женщин) и 103 КОЕ/мл (для мужчин). Рекомендуется интерпретировать клиническую значимость титра бактерий мочи не формально, а с учетом клинического состояния пациента, способа получения пробы мочи, патогенных свойств изолятов (их принадлеж­ности к первичным и вторичным уропатогенным агентам), метода определения титра бактерий.

Количественными критериями постановки диагноза ИМП служат:

  • при изоляции монокультуры E. coli и S. saprophyticus — титр больше или рав­ный 103 КОЕ/мл;
  • при изоляции монокультур других бактерий — титр больше или равный 104 КОЕ/мл;

при изоляции смешанной культуры двух бактерий — титр больше или рав­ный 105 КОЕ/мл.

У большинства пациентов заболевание мочевого тракта вызывает один возбудитель, реже два, но когда в моче обнаруживают три и более микроорга­низмов, то чаще всего это бывает обусловлено контаминацией тестированных проб или их посевов на питательные среды.

Не следует также забывать о том, что на ранних стадиях ИМП, при высоком уровне диуреза, недержании мочи, проведении бактериологического анализа после начала применения антимикробных препаратов, а также низком рН мочи, результаты оценки интенсивности бактериурии могут оказаться заниженными. В то же время следует иметь в виду, что моча представляет собой субстрат, в котором многие бактерии быстро размножаются при соответствующей их фи­зиологическим потребностям температуре. Поэтому большое влияние на титр бактерий в моче оказывают способы ее сбора, хранения и транспортировки.

Сбор мочи

     Наиболее достоверные результаты получают при сборе первой утренней мочи. Первая ее порция в наибольшей степени контаминирована обычной микрофлорой уретры пациента. Поэтому при подозрении на инфекцию дис-тального отдела мочевого тракта предпочтительнее собирать среднюю порцию мочи, а при симптомах поражений почек и мочевого пузыря — среднюю или по­следнюю. С целью избежания контамина­ции мочи пользуются также катетером или проводят пункцию мочевого пузыря, если оправдан риск травмирования тканей при таких процедурах.

     Мочу для бактериологического анализа собирают в стерильные контейнеры. Наибо­лее удобны специальные контейнеры, в крышке которых имеется 2 закры­вающихся отверстия: одно для вакуумной пробирки (в нее можно легко и быстро со­брать часть пробы без риска контаминации), второе — для дипслайда/дипстрика. Рис. 1. Контейнер для сбора мочи

Транспортировка мочи в лабораторию

     Важность информации о титре потенциально опасных бактерий в моче диктует необходимость быстрой (в течение не более 2 ч) ее доставки в лабора­торию. При отсутствии такой возможности пробы хранят в холодильнике до 12 ч. Замораживания мочи следует избегать, поскольку оно ведет к гибели боль­шого количества бактериальных клеток. Это может стать причиной не только неправильного определения их титра, но и невозможности изоляции патоген­ных бактерий на питательных средах. Однако упомянутые выше правила удается соблюдать не всегда (например, при самостоятельном сборе мочи пациентами в домашних условиях). Консер­вирование борной кислотой (10-20 г/л) позволяет дольше хранить предназна­ченные для исследований пробы мочи при комнатной температуре за счет по­давления роста бактерий и грибов. В настоящее время доступны контейнеры для мочи со стандартным количеством данного консерванта.

Питательные среды

     Важнейшие этапы диагностики ИМП — изоляция из мочи бактерий и опре­деление их титра. В этих целях обычно пользуются тремя типами питательных сред:

  • универсальными 
  • селективными
  • хромогенными.

    Универсальные среды обеспечивают рост тех видов бактерий, которые не нуждаются в специфических питательных веществах. Одна из лучших сред дан­ной группы — кровяной агар; его состав соответствует потребностям большин­ства уропатогенных бактерий. Он позволяет выявлять гемолитическую актив­ность бактерий. Склонные к роению протеи дают на этой среде обильный рост, мешая развитию других микроорганизмов и маскируя их колонии. Такого недо­статка лишена среда CLED. Однако ее дифференциально-диагностический по­тенциал ограничен ферментирующими лактозу бактериями, и она не пригодна для культивирования прихотливых бактерий (в частности тех, чей рост in vitro зависит от наличия в субстрате крови или сыворотки).

    Селективные среды обеспечивают благоприятные условия роста для опре­деленных видов микроорганизмов и подавляют остальные. При бактериологи­ческом исследовании мочи применяют среды Левина, МакКонки и Колумбий­ский CNA кровяной агар. В среде МакКонки соли желчных кислот содержатся в небольшой концентрации, поэтому ее можно считать умеренно-селективной по отношению к грамотрицательным бактериям. Входящий в состав среды кри-сталлвиолет, как и в среде Левина, ингибирует рост грамположительных бакте­рий, особенно энтерококков и стафилококков. Выросшие на ней энтеробакте-рии дифференцируют по способности ферментировать лактозу (розовая или красная окраска колоний на среде МакКонки и черная — на среде Левина). Ко­лумбийский CNA кровяной агар содержит колистин и налидиксовую кислоту, которые подавляют рост грамотрицательных бактерий. На этой среде стрепто­кокки группы В формируют бесцветные колонии, золотистый стафилококк -белые или золотистые, S. epidermis — белые, E. fecalis — серые, K. pneumoniae — чер­ные колонии.

    Хромогенные среды предназначены для изоляции и идентификации ми­кроорганизмов с помощью специфических компонентов, которые определен­ным образом меняют цвет при контакте с гомологичными им факторами (в пер­вую очередь ферментами бактерий), что позволяет идентифицировать продуцентов последних. Одной из хромогенных сред, предназначенных для бактериологического анализа мочи, является Uriselect3. Поскольку она очень питательна и не содержит селективных факторов, то на ней растут почти все уропатогенные бактерии. Колонии тех из них, которые образуют бета-глюкуронидазу, окрашиваются в розово-фиолетовый цвет (кишечная палочка), колонии бактерий, синтезирующих бета-глюкозидазу, становятся зелено-синими (цитробактеры, энтеробактеры, энтерококки, клебсиеллы, псевдомона­ды). Кроме того, в состав этой среды входит триптофан, что позволяет диффе­ренцировать изоляты на обладающие триптофан дезаминазой (колонии спонтанно окрашиваются в оранжево-коричневый цвет) и не синтезирующие этот фермент. Дополнительно образование индола выявляют нанесением на ко­лонии раствора перхлорита железа (реагент становится коричнево-зеленым) или реактива Ковача (реагент розовеет). Некоторые микроорганизмы, в т. ч. стафилококки и ацинетобактерии, формируют на среде Uriselect3 белые коло­нии, видовую принадлежность которых определяют дополнительными биохи­мическими тестами.

Способы определения титра бактерий в моче

    Золотым стандартом определения титра бактерий в моче остается ее посев на универсальные среды в чашках Петри. Способ основан на штриховом рас­пределении дозированного объема образца (1-100 мкл) по поверхности среды. Посев серийных разведений мочи дает наиболее точные результаты. Примене­ние калиброванных пластиковых бактериологических петель упрощает и уско­ряет данную процедуру, но не обеспечивает высокой точности исследований при титре бактерий ниже 104 КОЕ/мл.

    Полуколичественные методы определения титра бактерий в моче прово­дят с применением пластинок, покрытых питательными средами (дипслай-дов и др.). Хотя титр бактерий в моче, определенный количественными мето­дами, является более точным, упомянутые приспособления позволяют объединить несколько преаналитических и аналитических этапов, ускоряя тем самым получение результатов, что нередко имеет большее значение для клиницистов, чем очень точная информация о титре бактерий в исследован­ных пробах. Концентрацию бактерий определяют по числу выросших колоний через сутки после посева пробы. Одновременно отбирают колонии для установления морфологии изолятов (при низкой концентрации бактерий посевы инкубиру­ют еще сутки, а затем оценивают их морфологию).

Специальные приспособления для бактериологического анализа мочи

    При бактериологическом анализе мочи фактор времени имеет особое зна­чение: во-первых, как отмечалось выше, плотность популяции находящихся в моче бактерий при благоприятных условиях постепенно увеличивается, что не­редко ведет к получению ложноположительных результатов лабораторных ана­лизов; во-вторых, от точности и своевременности постановки диагноза зависит успешность лечения пациента. Снижение затрат времени на преаналитическом этапе повышает эффективность медицинской помощи пациентам с болезнями мочевыводящих путей. Стремясь к такой цели, Дж. П. Маккей и Г.Х. Сендис в 1965 г. испытали приспособление, представлявшее собой контейнер с пластико­вой ложкой, в которую залита питательная среда. Ее погружали в пробу мочи, переносили в контейнер и транспортировали в лабораторию. С помощью такого незамысловатого приспособления удалось свести преаналитический этап к процедуре сбора мочи и погружения в нее ложки со средой. Это можно было делать не только в поликлинике, но и непосредственно в домашних усло­виях, причем для проведения столь простой манипуляции не требовалась спе­циальная подготовка пациента или медицинского персонала. Исходная сте­рильность приспособления значительно снижала риск случайной контаминации посторонними микроорганизмами взятой пробы. Отпала необходимость в экс­тренной доставке взятой пробы мочи в лабораторию, т. к. рост бактерий в по­севе начинается с момента погружения дипслайда в мочу. Более того, выдержав в течение ночи в термостате приспособление с посевом, медсестра может в на­чале нового рабочего дня провести первичную оценку результатов: если при­знаки роста микроорганизмов отсутствуют, то отпадает необходимость в транс­портировке пробы мочи или ее посева в лабораторию для дальнейшего исследования (а следовательно значительно сокращаются затраты труда и вре­мени специалистов, а также расход реактивов, питательных сред и других средств).

    В последующем «ложку» Маккея — Сендис усовершенствовали, разделив на 2 сектора площадью около 310 мм2, которые заливали триптиказно-соевым ага­ром и средой Левина соответственно. Поскольку засев осуществляли погру­жением приспособления в мочу, то его назвали «дипслайдом». Со временем дип-слайд стал плоским и более компактным, т. к. среды стали заливать на его противоположные стороны. Пластинчатая форма дипслайда обеспечила равно­мерность посева, облегчила визуальный контроль роста бактерий. Наличие на пластинке нескольких сред расширило возможности и повысило результатив­ность анализа, снизив его трудоемкость и общую стоимость.

    Комбинации питательных сред, используемые при изготовлении дип-слайдов, постепенно оптимизировали. В начале 1960-х гг. фирма Oxoid (Вели­кобритания) предложила одну сторону пластинки заливать универсальной средой CLED для определения титра бактерий в моче по числу выросших ко­лоний, а другую — средой МакКонки, селективно поддерживающей рост боль­шинства энтеробактерий. Данная комбинация питательных сред стала основной.

    В 1990-х гг. компания ORION (Финляндия) приступила к выпуску дипслай-дов Uricult-Trio, одна сторона которых залита средой CLED, а другая — частично средой МакКонки, а частично агаровой основой с солями желчных кислот (для подавления роста грамположительных кокков), а также с 8-гидроксиквинолином-b-D-глюкуронидом и солью железа (для выявления (3-глюкуронидазы как марке­ра колиформных бактерий). На последней из упомянутых сред значительно ограничено роение протеев; образуемые ими и кишечной палочкой колонии можно спутать по форме и цвету.

    Применение дипслайдов значительно облегчает полуколичественную оцен­ку интенсивности бактериурии. Их устройство (компактность, комбинирова­ние на одной пластинке нескольких сред в небольшом количестве) обеспечива­ет экономию средств, облегчает транспортировку проб в лабораторию, требует очень небольшого места в термостате, а также меньших затрат времени и труда (поскольку посев на несколько сред происходит одновременно посредством простого погружения в пробу). Основное преимущество, предоставляемое дипслайдами, состоит в возможности посева на них мочи непосредственно у крова­ти больного или в поликлинике, куда тот принес пробу на анализ. Как след­ствие, снижается риск получения ложноположительных результатов оценки интенсивности бактериурии, обусловленных ростом популяции микроорганиз­мов в пробе мочи с момента ее взятия до анализа.

    Однако идеальными эти устройства считать нельзя из-за наличия у них ряда недостатков. Самым существенным является сплошной рост бактерий в посевах проб мочи с высокой концентрацией (более 105 КОЕ/мл). Чем меньше площадь пластинки, залитой питательной средой, тем чаще сплошной рост бак­терий мешает оценке их титра и изоляции отдельных колоний для изучения их морфологии и выращивания чистой культуры. В дипслайдах с тремя питатель­ными средами эта проблема в еще большей степени усугубилась из-за сокраще­ния площади засеваемых сред. Рекомендацию погружать дипслайды в мочу не более чем на 75% площади нельзя считать целесообразной: это никак не влияет на интенсивность роста микроорганизмов и не облегчает оценку их концентра­ции, хотя повышает шансы обнаружить подвижные виды бактерий, способные мигрировать в неконтактировавшие с пробой участки сред.

    Можно одновременно использовать несколько дипслайдов, засевая их цельной мочой и ее разведениями, но тогда надо смириться с большим расхо­дом средств на проведение анализа. Бывает сложно сделать посев на дипслайд небольшой порции мочи (например, взятой от новорожденных детей). Боль­шой объем мочи, абсорбируемый средами в процессе их засева, часто ведет в процессе инкубации к образованию конденсата, мешающего визуальному кон­тролю роста бактерий и делающего необходимым преждевременное открыва­ние контейнера с приспособлением.

    Для устранения перечисленных недостатков компания «Новамед» (Изра­иль) предложила новое техническое решение. Она выпустила приспособление (дипстрик), принципиально отличающееся от обычных дипслайдов тем, что по­сев на питательные среды осуществляется погружением в мочу не всей пла­стинки, а только специальной насадки. Последняя представляет собой пластиковое кольцо с зубцами. При опускании дипстрика в пробирку-контейнер кольцо остается у ее горлышка, а зубцы делают посев штрихом на средах обеих сторон дипстрика. Неодинаковая толщина зубцов обеспечивает захват разных по объему проб мочи. В сделанных ими штриховых посевах постепенно умень­шается концентрация бактерий, что обеспечивает формирование изолирован­ных колоний, если титр микроорганизмов в моче не превышает 107 КОЕ/мл. Минимальный титр бактерий, выявляемый приспособлением в моче, находит­ся в интервале от 5 х 102 до 5 х 103 КОЕ/мл.

    Приспособление выпускают с несколькими комбинациями сред: Uriselect3 + МакКонки (основная), CLED + МакКонки, а также CLED + CNA Колумбийский кро­вяной агар (дополнительные). С их помощью одновременно оценива­ют интенсивность бактериурии и идентифицируют уропатогенные возбудители в хромогенной среде Uriselect3, а также в среде МакКон-ки (грамотрицательные бактерии) и CNA Колумбийском агаре (грам-положительные бактерии). Параллельные исследования клинических проб мочи в дипслайде Uricult и дипстрике подтвердили превосходство нового приспособления по чувстви­тельности, специфичности, а также воспроизводимости результатов. На сегодняшний день дипстрик — единственное приспособление, сочетающее точность бактериологического анализа в чашках Петри с преимуществами дипслайдов, что позволяет говорить о появлении новой «дипстрик»-технологии. Дипстрики легко интегрируются в привычную практику работы лечебных и диагностических медицинских учреждений. Проще и удобнее транспортировать в лабораторию сделанный на них посев, чем пробы мочи пациентов. При этом значительно сокращается время, затрачиваемое на про­ведение бактериологического анализа. Данные приспособления позволяют быстро и точно устанавливать этиологию большинства ИМП. В тех случаях, когда изолированные на дипстрике бактерии не удается идентифицировать, не требуется повторно исследовать мочу — достаточно продолжить изучение морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств выросших колоний.

 

Б.Ф. Шуляк, 
зав. научно-инновационным отделом ООО «ГЕМ» (г. Москва),

С.С. Белокрысенко, 
зав. лабораторией проблем клинической микробиологии и контроля за госпитальными инфекциями Научно-исследовательского центра Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова





© 2009-2015 OOO «Лабораторные технологии»
Телефон/факс : +7 (342)291-21-91, 205-52-90
E-mail: labt1@yandex.ru